1987年日本研究人員在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)了成簇的規(guī)則間隔回文重復序列CRISPRs(Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats,CRISPRs)。2005年發(fā)現(xiàn)CRISPRs中的許多間隔序列與質(zhì)粒和病毒具有同源性，最后證實CRISPR-Cas是一種自適應的防御系統(tǒng)，可以使用反義RNA作為過去被入侵的記憶標記,當病毒再次入侵時即可做出快速反應。接下來的研究發(fā)現(xiàn)一共存在三種CRISPR-Cas系統(tǒng)類型(I、II和III)，它們分別使用不同的分子機制對核酸進行識別和剪切。I型和III型系統(tǒng)使用大量復雜的Cas蛋白作為crRNA介導的DNA剪切，由于其過于復雜，具體應用難度很大。然而，II型系統(tǒng)只需要一個單一的蛋白質(zhì)Case9，既可以實現(xiàn)基因的剪切，簡單方便，后來被證明對基因組工程非常有用，現(xiàn)在被廣泛應用于基因編輯和基因治療。

 

 

圖1 鏈球菌CRISPRs-Cas9抵抗病毒入侵的機制

 

上圖是鏈球菌的CRISPRs-Cas9抗病毒防御機制，Cas9是一種RNA引導的DNA核酸內(nèi)切酶，其需要在crRNA和tracrRNA雙RNA的指導下對特定DNA序列進行識別和切割。在CRISPR在基因座里包括tracrRNA、Cas9還有短的重復序列基因（如圖1a）。它們發(fā)揮作用的具體過程如下：短的重復序列基因轉(zhuǎn)錄成pre-crRNA，而tracrRNA對于pre-crRNA的成熟是必須的，Cas9具有核酸剪切能力。它們首先結合形成復合物，在核糖核酸酶Ⅲ作用下進一步成熟（如圖1b）。由于crRNA上的20個堿基能與目標DNA的堿基進行互補配對，可將復合物導向目標DNA，隨后Cas9對目標基因PAM序列（PAM序列為NGG，N為任意堿基）前的DNA序列進行剪切，導致目標DNA斷裂形成DSB（DNA double-stranded break，DBS）使入侵的病毒基因組發(fā)生斷裂（如圖1c），導致病毒死亡，進而抑制病毒感染。人們利用這種機制，通過尋找目的基因特異的PAM序列，將其5‘端前20個堿基一起合成crRNA,然后將tracrRNA和crRNA改造成單鏈導向的sgRNA(single guide RNA,sgRNA)（圖2）。同時共轉(zhuǎn)染Cas9，實現(xiàn)對目的基因的剪切。

 

 

 

圖2  改造后的CRISPs-Cas9系統(tǒng)

 

 然后利用生物體內(nèi)基因DBS的兩種修復方式對目的基因?qū)崿F(xiàn)編輯。具體兩種修復方式包括非同源重組修復（NHEJ）和同源重組修復（HDR）見圖3，NHEJ方式的修復會導致目的基因堿基的增加或缺失，導致基因可能發(fā)生移碼突變，達到基因敲除的目的。而HDR修飾是利用基因同源臂（如等位基因作為模板）可以進行同源重組所以可以進行精確修復，這樣人們可以通過外轉(zhuǎn)具有相同同源臂的質(zhì)粒，在同源臂內(nèi)插入基因就可以實現(xiàn)對目標基因的替換，進而實現(xiàn)基因編輯。

CRISPs-Cas9技術對基因編輯具有操作簡單、成本低、編輯效率較高等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用于疾病、腫瘤等治療，但是目前還存在脫靶效應、傳遞效率低、免疫排斥、倫理等問題。

 

 

圖3 基因組基因斷裂修復的兩種方式

 

 

主要參考文獻：Doudna, Jennifer A., and Emmanuelle Charpentier. "The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9." Science 346.6213 (2014): 1258096.