單堿基編器是近年才出現(xiàn)新的基因編輯系統(tǒng)，被認為是基因編輯技術(shù)3.0版本。該系統(tǒng)的基本原理是基于脫氨酶的作用，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）（Cytidine base editors, CBEs），或?qū)⑾汆堰剩ˋ）轉(zhuǎn)變成鳥嘌呤（G）（adenine base editors, ABEs），這種堿基間的相互轉(zhuǎn)換，不會引起雙鏈 DNA 的斷裂，利用其進行基因編輯，更加有效而又安全。而較早期的Cas9等基因編輯工具均會伴隨有DNA斷裂，后者會造成基因組的不穩(wěn)定性，對被編輯的生物機體帶來安全隱患。

單堿基編器出現(xiàn)以后，很快被廣泛地運用于動物、植物和人細胞的基因編輯。但是，以往的研究主要集中在單位點的堿基突變。而人類遺傳性疾病以及動物遺傳性狀改變往往涉及到多個位點的單堿基突變，因此，對基因組的多個位點進行單堿基編輯才更有可能培育出能夠模擬人遺傳性疾病的大動物模型和擁有優(yōu)良遺傳性狀的畜禽新品系。

近日，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學課題組在Nature Communications發(fā)表了題為 Efficient base editing for multiple genes and loci in pigs using base editors 的研究論文。首次從細胞、胚胎及動物三個層面探討了單堿基編輯器對豬多基因進行同時點突變的可行性，并且通過體細胞核移植和胚胎注射兩種途徑獲得兩種單位點單堿基突變豬模型（杜氏肌營養(yǎng)不良癥和早衰癥豬模型）和一種三位點單堿基突變豬模型（重癥免疫缺陷豬模型）。該成果的應用將加速生物醫(yī)藥相關(guān)的大動物豬模型培育和農(nóng)業(yè)精準育種。

該研究利用BE3和A3A-BE3兩種單堿基編輯工具，在細胞和胚胎層面，對基因組進行三基因單堿基編輯，每個基因設計一條gRNA，突變成終止密碼子或者突變誘導新的mRNA剪切位點。在胎胚上，三基因同時被編輯效率最高可達50%。而細胞層面，三基因同時編輯分別為最高可達25%。在很多動物體內(nèi)存在有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，這種基因系列相同的內(nèi)源性病毒往往以多拷貝的形式分布于染色體的不同位點。而豬內(nèi)源性病毒存在，給豬作為異種移植器官供體帶來安全隱患。本研究還對與豬內(nèi)源性病毒復制有關(guān)的pol基因單堿基突變，制造提前的終止密碼子，從而實現(xiàn)進行單基因的多位點失活。通過二代測序分析，可以看到在體細胞細胞內(nèi)，多拷貝的敲除率達到80%以上的，而在胚胎層面，71%病毒拷貝得到敲除。因此，本研究證明，單堿基編輯系統(tǒng)在細胞和胚胎水均可地實現(xiàn)多基因和或單基因多位點的高效堿基突變。

本研究進一步通過胚胎注射以及體細胞核克隆的途徑分別培育出了單基因突變豬和多基因突變豬。獲得了含有單基因突變的杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy, DMD）豬模型以及早衰癥（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS）豬模型，均極好地模擬了病人的表型。所獲得的與免疫細胞發(fā)育相關(guān)的三基因（RAG1、RAG2、IL2RG）純合突變豬的胸腺和脾臟發(fā)育有明顯缺陷，T細胞、B細胞及NK細胞缺失，免疫細胞不能進行V(D)J基因組重排，具有典型的重癥免疫缺陷表型。由于豬的免疫系統(tǒng)與人非常相似，這種重癥免疫缺陷豬模型將成為生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要基因修飾工具豬。

該論文的共同通訊作者為賴良學研究員以及王可品副研究員。廣州生物醫(yī)藥與健康研究院博士研究生謝精科、葛維凱、栗楠、劉琪帥為共同第一作者。