撰文 | 章臺(tái)柳

責(zé)編 | 兮

 

基因編輯的免疫細(xì)胞已經(jīng)作為“活體藥物”用于血液腫瘤的治療?；蚓庉嫾?xì)胞的首個(gè)成功案例就是利用病毒載體插入CAR（chimeric antigen receptor），使自體T細(xì)胞獲得靶向腫瘤抗原的特異性。CAR-T細(xì)胞成功的臨床案例證明在體外進(jìn)行基因修飾是安全可實(shí)現(xiàn)的，且具有顯著的持久的抗腫瘤效果。CAR-T在治療血液腫瘤上效果顯著，靶向CD19的CAR-T用于治療復(fù)發(fā)難治性急性淋巴細(xì)胞白血病，緩解效率達(dá)到80%。為了擴(kuò)展CAR-T在其他疾病的使用，研究人員在靶向抗原、與小分子藥物等傳統(tǒng)治療方法的聯(lián)合、下一代CAR的開發(fā)等方面進(jìn)行積極探索。

 

2019年6月3日，來自哈佛醫(yī)學(xué)院和麻省綜合醫(yī)院的Stefanie R. Bailey和Marcela V. Maus在Nature biotechnology雜志上發(fā)表綜述文章Gene editing forimmune cell therapies，詳細(xì)討論了基于免疫細(xì)胞（包括T、NK、單核細(xì)胞）、造血干細(xì)胞HSCs、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞開發(fā)的細(xì)胞療法中目前使用的合成生物學(xué)和基因編輯的策略及未來發(fā)展方向；探討了細(xì)胞治療在腫瘤、免疫耐受、感染性疾病和再生醫(yī)學(xué)中的潛在利用價(jià)值。

 

 

 

目前免疫細(xì)胞的基因編輯大多聚焦于T細(xì)胞，主要基于天然TCRs和抗體-T細(xì)胞信號(hào)結(jié)構(gòu)域融合成CAR兩種方式，靶向腫瘤抗原?？乖荏w天然以TCRs和抗體兩種形式存在。TCRs表達(dá)于T細(xì)胞中，識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體MHC所遞呈的多肽，使得T細(xì)胞能夠靶向胞質(zhì)蛋白。TCR-T細(xì)胞的靶標(biāo)主要針對(duì)自身譜系抗原（self-derived-lineage antigens），如黑色素瘤的MART-1（melanoma antigen recognized by T cells 1）、結(jié)直腸癌的CEA（carcinoembryonic antigen），癌癥-睪丸抗原中的NY-ESO-1。遺憾的是，目前僅有NY-ESO-1 TCR-T能夠很好的耐受，MART-1 TCR對(duì)眼睛、耳朵、皮膚產(chǎn)生on-target毒性，CEA TCR對(duì)結(jié)腸產(chǎn)生on-target毒性。在上皮癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具有識(shí)別突變抗原（neoepitopes）TCR的TIL具有治療癌癥的潛在價(jià)值，但是腫瘤逃逸依然存在。使用靶向KRAS G12D的TIL（tumor-infiltrating T lymphocytes）治療轉(zhuǎn)移性肺癌患者【1】，開始腫瘤進(jìn)展得到控制，隨后一例患者的腫瘤細(xì)胞通過丟失編碼HLA的等位基因進(jìn)行逃逸。美國國家癌癥中心最近開展了鑒定并使用neoantigen特異的TCRs治療多種實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)（NCT03412877）。突變特異性TCRs治療或?qū)⒊蔀樽罱K的個(gè)性化腫瘤特異性免疫治療。但是每個(gè)病人的腫瘤突變具有獨(dú)特性，尋找個(gè)性化TILs，測序并克隆TCRs，轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，整個(gè)過程目前不能自動(dòng)化操作，依賴于專家個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，時(shí)間和費(fèi)用將是TCR-T推廣和量產(chǎn)所面臨的最大挑戰(zhàn)。

 

傳統(tǒng)的CARs融合抗體的可變區(qū)和TCR信號(hào)分子，第二代CARs增加了共刺激分子的胞內(nèi)段，提高T細(xì)胞激活效率。與TCRs不同，CARs識(shí)別抗原不依賴于MHC，這也限制CARs只能識(shí)別細(xì)胞表面分子。CD19在正常B細(xì)胞表面很少表達(dá)，但普遍表達(dá)于B細(xì)胞惡性腫瘤，是CAR-T的理想靶標(biāo)。CD19-CAR-T在臨床取得顯著的治療效果，對(duì)復(fù)發(fā)性或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病的緩解超過80%，被FDA批準(zhǔn)用于治療難治性B細(xì)胞白血病和淋巴瘤【2,3】。靶向BCMA（B cell maturation antigen）的CAR-T用于治療多發(fā)性骨髓瘤也正在開展臨床試驗(yàn)。靶向其他抗原的CAR-T正在研發(fā)中，比如CD20（B細(xì)胞）、CS1（SLAMF7，漿細(xì)胞）、CD5（T細(xì)胞）、CD37（T和B細(xì)胞）等。但是所有的靶點(diǎn)都是譜系特異的，而不是腫瘤特異的，這就導(dǎo)致清除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也清除一些必需的血液細(xì)胞；例如CD33 CAR-T用于治療髓系白血病時(shí)，必需的成熟粒細(xì)胞也被清除，可以利用基因編輯技術(shù)在自體HSC中敲除CD33后移植治療，以恢復(fù)正常的髓系細(xì)胞譜系。缺乏腫瘤特異性表面抗原限制CAR-T技術(shù)用于實(shí)體瘤治療。在腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)的抗原如mesothelin和Her2，在正常組織中也有表達(dá)，這就會(huì)導(dǎo)致on-target毒性。少數(shù)嚴(yán)格限制在腫瘤中表達(dá)的抗原如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表達(dá)的EGFRvIII，則存在異質(zhì)性表達(dá)，限制了CAR-T的使用。

 

 

為了擴(kuò)展CAR-T的治療領(lǐng)域，研究人員在CAR的設(shè)計(jì)上有眾多創(chuàng)新之舉。為了提高T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的特異性，采取雙受體模式。Fedorov等設(shè)計(jì)了識(shí)別腫瘤抗原CAR，同時(shí)表達(dá)抑制性CAR，PD-1或CTLA-4，抑制CAR-T對(duì)正常組織的殺傷作用。Lim等的方案是抗原A的識(shí)別驅(qū)動(dòng)靶向抗原B的CAR轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為了解決腫瘤下調(diào)抗原或抗原表達(dá)抑制性導(dǎo)致的腫瘤逃逸，采用separate transduction、co-tranduction或者tandem CAR等技術(shù)同時(shí)靶向多個(gè)抗原或許是新的方向。目前20項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在開展以檢測同時(shí)靶向CD19/CD20及CD19/CD22的治療效果。腫瘤抑制性微環(huán)境是CAR-T應(yīng)用于實(shí)體瘤的一大挑戰(zhàn)，編輯CAR-T使之能分泌anti-PD-L1、敲除PD-1的表達(dá)、IL-4-IL-7將IL-4抑制信號(hào)轉(zhuǎn)變成IL-7激活信號(hào)等或許能克服腫瘤抑制性作用。

 

目前在T細(xì)胞中表達(dá)CAR主要基于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，但其轉(zhuǎn)基因的載量有限，隨著轉(zhuǎn)基因數(shù)目增加，病毒的滴度及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率都減弱。為了克服這些問題，一些非病毒的基因編輯技術(shù)發(fā)展起來，如使用轉(zhuǎn)座子技術(shù)的Sleeping Beauty和piggyBac。使用Sleeping Beauty編輯的CD19+ CAR-T聯(lián)合自體或異體HSC移植達(dá)到總生存率100%及63%的治療效果。不過轉(zhuǎn)座子體系使用大量的DNA用于轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，基因表達(dá)水平不高。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)體系存在另一問題是整合位點(diǎn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒傾向整合到造血細(xì)胞的LMO基因位點(diǎn)，導(dǎo)致白血病的發(fā)生。整合位點(diǎn)會(huì)影響治療效果，一名患者經(jīng)整合到TET2基因的CD19-CAR-T治療后，獲得疾病的完全緩解。臨床前研究表明，使用TALENs（transcription activator–like effector nucleases）、homing ednonucleases、CRISPR-Cas9等技術(shù)將CAR特異性整合到特定的基因位點(diǎn)（如內(nèi)源TCR）不僅僅提高抗腫瘤治療效果，而且有助于“off-the-shelf”商品化CAR-T的生產(chǎn)。

 

 

 

基因編輯技術(shù)不僅應(yīng)用于T細(xì)胞，在NK、巨噬細(xì)胞、造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞中都有探索。NK細(xì)胞具有細(xì)胞溶解功能，抗病毒、抗腫瘤作用，因?yàn)槿狈?dǎo)致GvHD（移植物抗宿主?。?/span>的TCR，更易制成“off-the-shelf”商品。臨床的前期數(shù)據(jù)表明商品化的CD19 CAR NK細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性腫瘤具有安全性和有效性【4】。但是NK細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低、需要高濃度IL-2或者IL-15支持存活等特點(diǎn)是基因編輯NK細(xì)胞的困難之處。使用基因編輯技術(shù)，改變巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的抑制性作用主要通過以下途徑：分泌輔助T、NK的細(xì)胞因子如IL-21；下調(diào)抑制性基因IL-10和PD-L1的表達(dá)；降低‘don’t eat me’受體SIRP-α的表達(dá)，增強(qiáng)吞噬作用。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）和造血干細(xì)胞（HSCs）可以用來產(chǎn)生攜帶腫瘤特異性TCR或CAR的T細(xì)胞。產(chǎn)生的T細(xì)胞具有自我更新能力，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的持久性，延長療效。但其副作用事件不得不考慮，除了CAR靶向相關(guān)的B細(xì)胞再生障礙性貧血及細(xì)胞因子釋放綜合癥，還有大量細(xì)胞分裂導(dǎo)致的基因組潛在改變及iPSCs不分化導(dǎo)致的細(xì)胞水平毒性。使用基因編輯技術(shù)改造非造血干細(xì)胞如NSCs（neural stem cells）和MSCs（mesenchymal stem cells），可以實(shí)現(xiàn)釋放有害于腫瘤生長的酶類、搭載前藥系統(tǒng)、遞送納米顆粒藥物、遞送抗腫瘤物質(zhì)如IFN、遞送溶瘤病毒等功能，抑制腫瘤生長。

 

 

基因編輯的免疫細(xì)胞不僅在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，而且具有應(yīng)用于感染性疾病、移植排斥、自身免疫性疾病的潛在價(jià)值。例如編輯Treg細(xì)胞中表達(dá)TCR或CAR，或者表達(dá)免疫抑制性細(xì)胞因子如IL-10，抑制免疫反應(yīng)，提高機(jī)體耐受。T細(xì)胞中表達(dá)抗自體抗體的CAR，直接殺傷自體反應(yīng)B細(xì)胞，緩解自身免疫疾病。靶向CD4的CAR-T及基因編輯失活CCR5的T細(xì)胞不但干擾HIV的感染過程，而且殺傷HIV感染的細(xì)胞。目前一項(xiàng)利用基因編輯CAR+C34– CXCR4+CCR5+ T細(xì)胞治療HIV的臨床試驗(yàn)正在開展。

 

總的來說，CD19-CAR-T在臨床上顯著的抗腫瘤效果促進(jìn)免疫細(xì)胞編輯領(lǐng)域的快速發(fā)展，也推動(dòng)CAR的設(shè)計(jì)和遞送系統(tǒng)領(lǐng)域的創(chuàng)新。在NK、巨噬細(xì)胞、干細(xì)胞等不同種類中的編輯更是將免疫細(xì)胞治療從抗腫瘤免疫擴(kuò)展到感染性疾病、自身免疫病的治療。使用基因編輯技術(shù)改造免疫細(xì)胞具有非?？捎^的應(yīng)用前景。

 

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0137-8

 

制版人：小嫻子

 

 

參考文獻(xiàn)

 

 

1. Tran, E. et al.T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS in Cancer. N. Engl. J. Med. 375,2255-2262, doi:10.1056/NEJMoa1609279 (2016).

2. Maude, S. L. et al. Tisagenlecleucel inChildren and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.N. Engl. J. Med. 378,439-448, doi:10.1056/NEJMoa1709866 (2018).

3. Schuster, S. J. et al. Tisagenlecleucelin Adult Relapsed or Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma. N. Engl. J. Med.380, 45-56, doi:10.1056/NEJMoa1804980 (2019).

4. Liu, E. et al. Cord blood NK cellsengineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistenceand potent antitumor activity. Leukemia 32, 520-531, doi:10.1038/leu.2017.226(2018).