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斑馬魚基因敲降思路

發(fā)布時(shí)間:

2019-06-28

 基因敲降項(xiàng)目的一般工作思路：

1）首先分析目標(biāo)基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期是否有表達(dá)（如果沒(méi)有表達(dá)，則根本不存在敲降問(wèn)題）。
2）設(shè)計(jì)并安排實(shí)驗(yàn)（RT-PCR）檢測(cè)目標(biāo)基因在胚胎發(fā)育早期的表達(dá)情況（目的在于確認(rèn)目標(biāo)基因在胚胎發(fā)育早期有表達(dá)，同時(shí)在有表達(dá)的情況下建立檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)的檢測(cè)方法）。實(shí)際上，即使數(shù)據(jù)庫(kù)中有描述該基因在胚胎發(fā)育早期有表達(dá)，也要開展此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
3）在確認(rèn)該基因在胚胎發(fā)育早期有表達(dá)的情況下，再設(shè)計(jì)MO，然后訂購(gòu)MO（阻斷翻譯型MO-ATG和/或阻斷原始mRNA剪接型MO-S）。在胚胎注射MO-S以驗(yàn)證MO-S是否能有效阻斷目標(biāo)基因原始mRNA的剪接（請(qǐng)注意，斑馬魚領(lǐng)域內(nèi)的專家已經(jīng)達(dá)成MO-ATG不再要求驗(yàn)證其活性。實(shí)際上是源于MO-ATG無(wú)法進(jìn)行活性驗(yàn)證，故而我們推薦使用CRISPRi策略從抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的水平上建立基因敲降的方法）。